表19 大肠菌群(MPN)检索表 (总接种量55.5mL,其中5份10mL水样,5份1mL水样,5份0.1mL水样)
接种量,mL MPN/100 mL 接种量,mL MPN/100
mL
10 1 0.1 10 1 0.1
0 0 0 0 1 0 1 4
0 0 1 2 1 0 2 6
0 0 2 4 1 0 3 8
0 0 3 5 1 0 4 10
0 0 4 7 1 0 5 12
0 0 5 9 1 1 0 4
0 1 0 2 1 1 1 6
0 1 1 4 1 1 2 8
0 1 2 6 1 1 3 10
0 1 3 7 1 1 4 12
0 1 4 9 1 1 5 14
0 1 5 11 1 2 0 6
0 2 0 4 1 2 1 8
0 2 1 6 1 2 2 10
0 2 2 7 1 2 3 12
0 2 3 9 1 2 4 15
0 2 4 11 1 2 5 17
0 2 5 13 1 3 0 8
0 3 0 6 1 3 1 10
0 3 1 7 1 3 2 12
0 3 2 9 1 3 3 15
0 3 3 11 1 3 3 17
0 3 4 13 1 3 5 19
0 3 5 15 1 4 0 11
0 4 0 8 1 4 1 13
0 4 1 9 1 4 2 15
0 4 2 11 1 4 3 17
0 4 3 13 1 4 4 19
0 4 4 15 1 4 5 22
0 4 5 17 1 5 0 13
0 5 0 9 1 5 1 15
0 5 1 11 1 5 2 17
0 5 2 13 1 5 3 19
0 5 3 15 1 5 4 22
0 5 4 17 1 5 5 24
0 5 5 19 2 0 0 5
1 0 0 2 2 0 1 7
表 19
接种量,mL MPN/100 mL 接种量,mL MPN/100mL
10 1 0.1 10 1 0.1
2 0 2 9 3 1 5 27
2 0 3 12 3 2 0 14
2 0 4 14 3 2 1 17
2 0 5 16 3 2 2 20
2 1 0 7 3 2 3 24
2 1 1 9 3 2 4 27
2 1 2 12 3 2 5 31
2 1 3 14 3 3 0 17
2 1 4 17 3 3 1 21
2 1 5 19 3 3 2 24
2 2 0 9 3 3 3 28
2 2 1 12 3 3 4 32
2 2 2 14 3 3 5 36
2 2 3 17 3 4 0 21
2 2 4 19 3 4 1 24
2 2 5 22 3 4 2 28
2 3 0 12 3 4 3 32
2 3 1 14 3 4 4 36
2 3 2 17 3 4 5 40
2 3 3 20 3 5 0 25
2 3 4 22 3 5 1 29
2 3 5 25 3 5 2 32
2 4 0 15 3 5 3 37
2 4 1 17 3 5 4 41
2 4 2 20 3 5 5 45
2 4 3 23 4 0 0 13
2 4 4 25 4 0 1 17
2 4 5 28 4 0 2 21
2 5 0 17 4 0 3 25
2 5 1 20 4 0 4 30
2 5 2 23 4 0 5 36
2 5 3 26 4 1 0 17
2 5 4 29 4 1 1 21
2 5 5 32 4 1 2 26
3 0 0 8 4 1 3 31
3 0 1 11 4 1 4 36
3 0 2 13 4 1 5 42
3 0 3 16 4 2 0 22
3 0 4 20 4 2 1 26
3 0 5 23 4 2 2 32
3 1 0 11 4 2 3 38
3 1 1 14 4 2 4 44
3 1 2 17 4 2 5 50
3 1 3 20 4 3 0 27
3 1 4 23 4 3 1 33
续表 19
接种量,mL MPN/100 mL 接种量,mL MPN/100mL
10 1 0.1 10 1 0.1
4 3 2 39 5 1 4 110
4 3 3 45 5 1 5 130
4 3 4 52 5 2 0 49
4 3 4 59 5 2 1 70
4 4 0 34 5 2 2 94
4 4 1 40 5 2 3 120
4 4 2 47 5 2 4 150
4 4 3 54 5 2 5 180
4 4 4 62 5 3 0 79
4 4 5 69 5 3 1 110
4 5 0 41 5 3 2 140
4 5 1 48 5 3 3 180
4 5 2 56 5 3 4 210
4 5 3 64 5 3 5 250
4 5 4 72 5 4 0 130
4 5 5 81 5 4 1 170
5 0 0 23 5 4 2 220
5 0 1 31 5 4 3 280
5 0 2 43 5 4 4 350
5 0 3 58 5 4 5 430
5 0 4 76 5 5 0 240
5 0 5 95 5 5 1 350
5 1 0 33 5 5 2 540
5 1 1 46 5 5 3 920
5 1 2 63 5 5 4 1600
5 1 3 84 5 5 5 >1600
52.1.5.2 可饮用的矿泉水 矿泉水出厂水或准备饮用的矿泉水,一般不应有污染,需要经常检验可按下法进行接 种。 推测性检验
52.1.5.2.1 用10mL的灭菌吸管向5支盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中,每管接种10mL水样。
52.1.5.2.2 置36±1℃培养箱中培养24h,观察每支管的产气情况,如有气体产生,则认为推测性检验阳性。 证实性检验
52.1.5.2.3 以下操作同矿泉水水源水检验。
52.1.5.2.4 MPN值的计算 例如经过证实性检验后,大肠菌群有3管阳性,从表20查得MPN为9.2/100mL。 表 20 用5管10mL水样时各种阳性和阴性结果 组合的MPN值及其95%的可信限
阳性反应管数 MPN/100mL 95%可信限
下限 上限
0 0 0 6.0
1 2.2 0.1 12.6
2 5.1 0.5 19.2
3 9.2 1.6 29.4
4 16 3.3 52.9
5 >16 8.0 无限
52.2 滤膜法
52.2.1 测定范围 本法适用于大肠菌群的测定 。
52.2.2 方法提要 滤膜是一种微孔薄膜,孔径为0.45μm,能滤过大量水样,并将水中所含的细菌截留在 滤膜上,然后将滤膜贴在选择性鉴别培养基上,经37℃培养24h后,大肠菌群细菌在滤膜上长出具有特征性的菌落,直接计数典型菌落数,计算出每100mL水样中所含的大肠菌群数。
52.2.3 培养基和试剂
52.2.3.1 远藤琼脂(品红亚硫酸钠)培养基
52.2.3.1.1 成分 蛋白胨10g 酵母浸膏5g 牛肉膏5g 乳糖10g 琼脂15～20g磷酸氢二钾3.5g 无水亚硫酸钠5g 5%碱性品红酒精溶液20mL 蒸馏水1000 mL
52.2.3.1.2 制法 储备培养基的制备: 先将琼脂加到500mL蒸馏水中,煮沸溶解,于另一500mL蒸馏水中,加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏,加热溶解,倒入已溶解的琼脂,补足蒸馏水至1 000mL,混匀 后调PH为7.2～7.4,再加入乳糖,分装,115℃灭菌20min,储存于冷暗处备用。平皿培养基的配制: 将上法配制的储备培养基加热融化,用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红酒精溶液置于灭菌空试管中,再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌试管中,加灭菌水少许,使其溶解后,置沸水浴中煮沸10min以灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红酒精溶液内至深红色褪成 粉色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此种培养基15mL倒入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变成深红色,,则不能再用。
52.2.3.2 乳糖蛋白胨培养液
52.2.3.2.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水 1000mL
52.2.3.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于蒸馏水中加热溶解,调pH为7.2～7.4,再加入1mL1.6%溴甲酚紫乙醇溶液,充分混匀,分装于装有倒管的试管中,以115℃20min高压灭菌,储备冷暗处备用。
52.2.3.3 革兰氏染色法
52.2.3.3.1 结晶紫染色液 结晶紫1g 95%酒精20mL 1%草酸铵溶液80mL注:结晶紫不可用龙胆紫代替,前者是纯品,后者不是单一成分,易出现假阳性。结晶紫溶液放置过久会产生沉淀,不能再用。
52.2.3.3.2 革兰氏碘液 碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300mL 将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加入其余 的蒸馏水。注:当溶液由棕色变为淡黄色时即应弃去。
52.2.3.3.3 脱色剂:95%乙醇。
52.2.3.3.4 沙黄复染液 沙 黄 0.25g 95%酒精 10mL 蒸馏水 90mL 将沙黄溶解于酒精中,待完全溶解后加入蒸馏水。
52.2.3.3.5 染色法
52.2.3.3.5.1 将培养18～24h的培养物涂片。
52.2.3.3.5.2 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
52.2.3.3.5.3 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
52.2.3.3.5.4 滴加脱色剂,摇动玻片,直至无紫色脱落为止,约30s,水洗。
52.2.3.3.5.5 滴加复染剂,复染1min,水洗,待干,镜检。呈紫色者为革兰氏阳性菌;呈红色者为革兰氏阴性菌。
52.2.4 仪器
52.2.4.1 滤器。
52.2.4.2 滤膜:孔径为0.45μm,直径根据滤器规格,目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。
52.2.4.3 抽滤设备。
52.2.4.4 无齿镊子。
52.2.4.5 显微镜。
52.2.4.6 载玻片。
52.2.4.7 其他仪器同52.1.4。
52.2.5 检验步骤
52.2.5.1 先将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置沸水浴中煮沸灭菌3次,每次15min。前两次煮沸后需更换水,再蒸馏水洗涤2次,以除去残留溶剂。
52.2.5.2 用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗面向上,贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,加100mL水样,在负压0.5大气压下抽滤。
52.2.5.3 水样滤完后,取下滤器,用灭菌镊子夹住滤膜边缘部分,移放到远藤培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37℃培养箱培养18～24h。
52.2.5.4 大肠菌群在远藤培养基上具有以下特征: 紫红色,具有金属光泽的菌落;深红色,不带或略带金属光泽的菌落;淡粉色,中心较深的菌落。 挑取可疑菌落涂片、染色、镜检。
52.2.5.5 凡系革兰氏阴性无芽胞杆菌,再接种乳糖蛋白胨培养液,经37℃培养24h后,如产酸产气则判定为大肠菌群阳性。
52.2.5.6 计算滤膜上的大肠菌群菌落数,以每100mL水样中的大肠菌群数报告之。
数出的总大肠菌群菌落数×100
每100mL水中大肠菌群菌落数＝──────────────- ………(97)
过滤的样品量(mL)
附 录 A 饮用天然矿泉水参考指标检验方法 (参考件)
A1 铍
A1.1 桑色素荧光分光光度法
A1.1.1 测定范围 本法适用范围为0.2～1.0μg/L,最低检测浓度为0.2μg/L。
A1.1.2 方法提要 铍在碱性溶液中与桑色素反应生成黄绿色的荧光化合物,测定荧光强度定量。低量的铍在pH5～8与乙酰丙酮形成可被四氯化碳萃取的化合物予以富集。
A1.1.3 试剂
A1.1.3.1 刚果红试纸。
A1.1.3.2 盐酸溶液50g/L,1mol/L和6mol/L三种浓度。
A1.1.3.3 氢氧化钠(40g/L):4g氢氧化钠溶于100mL纯水中。
A1.1.3.4 乙二胺四乙酸二钠溶液(100g/L):称取10g乙二胺四乙酸二钠,置于50mL烧A
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