小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法

中华人民共和国国家标准
小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA) GB/T 14933-94
Method for determination of T-2 toxin in wheat with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELlSA)。
　　本标准适用于小麦及其制品中T-2毒素的测定。
　　本方法的最低检出量为1μg/kg。
　　　　　　　　　　　　　　第-篇　间　接　法
2　原理
　　将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。
3　试剂
　　本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或用等纯度的水。
3.1　甲醇。
3.2　石油醚。
3.3　三氯甲烷。
3.4　无水乙醇。
3.5　乙酸乙酯。
3.6　二甲基甲酰胺。
3.7　四甲基联苯胺(TMB)。
3.8　吐温-20。
3.9 30%过氧化氢(30%H2O2)。
3.10 抗体：杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。
3.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)的结合物。
3.12 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。
3.13 ELISA缓冲液系统
3.13.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,称取1.59g碳酸钠(Na2CO3),2.93g碳酸氢钠(NaHCO3)，加水稀释至1000 ml。
3.13.2 洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为：
　　称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)2.9g,氯化钠(NaCl)8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,吐温-20 0.5mL,加水至1000mL。
3.13.3　底物缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：
　　0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7*H2O)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液:
　　0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4), 即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000 mL，为乙液:
　　取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。
3.13.4　底物溶液：取50μL TMB(10 mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液+10 mL底物缓冲液+10μL30%过氧化氢，混均。
3.14 T-2毒素标准溶液
　　用甲醇配成1mg/mL T-2毒素贮备液,-20℃冰箱贮存，于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加叶温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。
4　仪器 　　所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。
4.1　酶标检测仪。
4.2　酶标板(40孔或96孔)。
4.3　电动振荡器。
4.4　电热恒温水浴锅。
4.5　具0.2mL尾管的10 mL小浓缩瓶。
5　分析步骤
5.1　提取
　　称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200 mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100 mL三氯甲烷-无水乙醇(4:1)，密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25 mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250 mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水(4:1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min,静置约15 min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化(层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱纸棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧)。
　　将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3ml，乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后。用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。
5.2 ELISA检测
5.2.1　用T-2-BSA(4μg/mL)包被酶标板，每孔100 μL，4℃过夜；
5.2.2　酶标板用PBS-T洗3次、每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线) 或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1:1，每孔100μL，该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用)，置37℃1h；
5.2.3　酶标板洗3次，每次3min后，加入酶标二抗，每孔100 μL，37℃，1.5h；
5.2.4　同上述洗涤后，加入底物溶液，每孔100 μL，37℃ 30min；
5.2.5　用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50 μL，于450 nm处测定吸光度值。
6　计算 T-2浓度(ng/g) = C × V1/V2 × D × 1/M 式中：C--酶标板上所测得的T-2毒素的量(ng)，根据标准曲线求得;
　　V1--样品提取液的体积mL;
　　V2--滴加样液的体积，mL;
　　D--样液的总稀释倍数;
　 　M--样品质量，g。
7　精密度
　　本法的精密度为6.8～20.3，平行允许差为4.7%～19.2%。
　　　　　　　　　　　　　　第二篇　直　接　法
8　原理
　　将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。
9　试剂
　　本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。
9.1　甲醇。
9.2　石油醚。
9.3　三氯甲烷。
9.4　无水乙醇。
9.5　乙酸乙酯。
9.6　二甲基甲酰胺。
9.7　四甲基联苯胺(TMB)。
9.8　吐温-20。
9.9 30%过氧化氢(30%H2O2)。
9.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。
9.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物(T-2-BSA)。
9.12 ELISA　缓冲液系统
9.12.1　包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠(Na2CO3)，2.93g碳酸氢钠(NaHCO3)，加水稀释至1000 mL。
9.12.2　洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH3PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO·12H20)2.9g,氯化钠(NaCl)8.0g, 氯化钾(KCl)0.2g,吐温-20 0.5mL，加水至1000 mL。
9.12.3　底物缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：
　　0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7·H2O)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；
　　0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000 mL,为乙液；
　　取甲液24.3mL、乙液25.7mL，加水至100 mL，即可。
9.12.4　底物溶液：取50 μL TMB(10 mg TMB溶于1mL二甲基甲酸胺中)溶液＋10 mL底物缓冲液＋10 μL 30%过氧化氢，混均。
9.13 T-2毒素标准溶液 用甲醇配成1mg/ml T-2毒素贮备液，-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液, 用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。
10 仪器
　　所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。
10.1　酶标检测仪。
10.2 酶标板(40孔或96孔)。
10.3　电动振荡器。
10.4　电热恒温水浴锅。
10.5　具0.2mL尾管的10 mL小浓缩瓶。
11 分析步骤
11.1　提取
　　称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200 mL，具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100 ml三氯甲烷-无水乙醇(4:1)，密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25 mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50ml石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250 mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水(4:1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min,静置约15min, 收下层甲醇-水提取液过层析柱净化(层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约 0.1g脱纸棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳,敲紧)。
　　将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。
11.2 ELISA　检测
11.2.1　用T-2-BSA(4μg/mL)包被酶标板，每孔100 μL，4℃过夜。
11.2.2　酶标板用PBS-T洗3次,每次3min后,加入不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品毒素含量)与抗体-酶结合物溶液 (1:100) 的混合液 (1:1, 每孔100μL, 该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用)，置37℃ 1.5h。
11.2.3　酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液。每孔100 μL，37℃30 min。
11.2.4　用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50 μL，于450 nm处测定吸光度值。
12 计算 T-2浓度(ng/g) = C×V1/V2×D×1/m 式中：C--酶标板上所测得的T-2毒素的量(ng)，根据标准曲线求得；
　　 V1--样品提取液的体积，mL;
　　 V2--滴加样液的体积，mL；
　　　D--样液的总稀释倍数；
　　　m--样品质量，g。
13 精密度
　　本法的精密度为5.3～15.4，平行允许差为5.7%～14.2%。

附加说明，
　本标准由卫生部卫生监督司提出。
　本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
　本标准主要起草人阳传和、罗雪云、计融。
　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

中华人民共和国卫生部1994-01-24批准　　1994-08-01实施