(一)实验目的:学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
(二)实验原理:用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。
(三)实验器材
1、活材料:培养12-16h的苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)或者枯草杆菌(Bacillussubtilis),培养24小时的大肠杆菌(Escherichia coli)
2、染色液和试剂:结晶紫(附二、(一)、3)、卢哥氏碘液(附二、(一)、4)、95%酒精、蕃红(附二、(一)、5)、复红(附二(一)、2)、二甲苯、香柏油
3、器材:废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜
(四)实验方法:
1、简单染色: