中华人民共和国国家标准
食物中硒的测定方法 GB12399-90
Method for determination of selenium in foods
1 主题内容与适用范围
本标准规定了用荧光法测定食物中的硒含量。
本标准适用于各类食物中硒的测定。
2 原理
样品经混合酸消化后,硒化合物被氧化为四价无机硒(Se4+),与2,3-二氨基萘(2,3-diaminonaphthalene,简称DAN)反应生成4,5-苯并苤硒脑(4,5-benzo piaselenol),其荧光强度与硒的浓度在一定条件下成正比。用环己烷萃取后于激发光波长376 nm,发射光 波长520nm处测定荧光强度,与绘制的标准曲线比较定量。本方法检出限为3ng。
3 试剂
3.1 环己烷。
3.2 硝酸。
3.3 过氯酸。
3.4 盐酸。
3.5 氢溴酸。
3.6 1+9盐酸溶液：取10mL盐酸,加90mL水。
3.7 1+1氨水。
3.8 5+95去硒硫酸：取5mL去硒硫酸,加于95mL水中。
去硒硫酸：取200mL硫酸,加于200mL水中,再加30mL氢溴酸,混匀,置沙浴上加热蒸去硒与水至出现浓白烟,此时体积应为200 mL。
3.9 0.2mol/L EDTA：称37g EDTA二钠盐,加水并加热溶解,冷却后稀释至500mL。
3.10 10%盐酸羟胺：称取10g盐酸羟胺溶于水中,稀释至100 mL。
3.11 混合酸：硫酸+过氯酸(2+1)。
3.12 0.1%2,3-二氨基萘(纯度95%～98%)需在暗室配制。称取200mg DAN于一带盖三角瓶中,加入200mL0.1mol/L盐酸,振摇约l5min,使其全部溶解。约加40mL环己烷,继续振摇5min,将此液转入分液漏斗中,待溶液分层后,弃去环己烷层,收集DAN层溶液。如此用环己烷纯化DAN直至环己烷中的荧光数值降至最低时为止(纯化次数视DAN纯度不同而定,一般约需纯化3～4次)。将提纯后的DAN溶液储于棕色瓶中,约加1cm厚的环己烷覆盖溶液表面。置冰箱中保存,必要时再纯化一次。
3.13 硒标准溶液
3.13.1 硒标准储备液(100μg/mL)：精确称取100.0mg元素硒(光谱纯),溶于少量硝酸中,加2mL过氯酸,置沸水浴中加热3～4h,冷却后加入8.4mL盐酸,再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL,其盐酸浓度为0.1mol/L。此储备液浓度为100μg/mL。
3.13.2 硒标准使用液(0.05μg/mL)：将3.13.1液用0.1mol/L盐酸稀释,使含硒为0.O5μg/mL。于冰箱中保存。
3.14 0.02%甲酚红指示剂:称取50mg甲酚红溶于水中,加1+1氨水1滴,待甲酚红完全溶解后加水稀释至250mL。
3.l5 EDTA混合液:取(3.9)和(3.10)液各50mL,混匀,再加5mL (2.14)溶液,用水稀释至1L。
4 仪器和设备
4.1 实验室常用设备。
4.2 荧光分光光度计。
5 操作步骤
5.1 样品处理及消化
5.1.1 粮食：样品用水洗三次,60℃烘干,用不锈钢磨磨成粉,储于塑料瓶内,放一小包樟脑精,盖紧盖保存,备用。
5.1.2 蔬菜及其他植物性食物,取可食部用水冲洗三次后用纱布吸去水滴,用不锈钢刀切碎,取混合均匀的样品于60℃烘干,称重,粉碎、备用。
5.1.3 称取0.5～2.0g样品(含硒量0.01～0.5μg)于磨口三角瓶内,加10mL 5+95去硒硫酸,样品湿润后,再加20mL混合酸液放置过夜。次日于沙浴上逐渐加热,当激烈反应发生后(溶液变无色),继续加热至产生白烟,溶液逐渐变成淡黄色即达终点。某些蔬菜样品消化后常出现浑浊,难以确定终点,所以要细心观察,还有含硒较高的蔬菜含有较多的Se6+,需要在消化达到终点时冷却后加10mL 1+9 盐酸,继续加热,使Se6+还原成Se4+。按上述方法确定终点。
5.2 测定
于样品消化液中加20mL EDTA混合液,用氨水(1+1)或盐酸调至淡红橙色(pH1.5～2.0)。以下步骤在暗室进行:加3mL DAN试剂,混匀,置沸水浴中煮5min,取出立即冷却,加3mL环己烷,振摇4min,将全部溶液移入分液漏斗,待分层后弃去水层,环己烷层转入带盖试管中,小心勿使环己烷中混入水滴,于激发光波长376nm,发射光波长520 nm处测定苤硒脑的荧光强度。
5.3 硒标准曲线绘制:准确吸取硒标准使用液0、0.2、1.0,2.0及4.0mL,加水至5mL,按样品测定步骤同时进行。硒含量在0.5μg以下时荧光强度与硒含量呈线性关系,在常规测定样品时,每次需做试剂空白与样品含硒量相近的标准管(双份)即可。
6 计算
C - B 1
X=━━━━×S ×━━
A - B m
式中：X──样品中硒含量,μg/g；
A──标准管荧光读数；
S──空白管荧光读数；
C──样品管荧光读数；
S─-标准管硒含量,μg;
m──试样质量,g。
7 结果的允许差
同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%。
附加说明：
本标准由中华人民共和国卫生部卫生监督司提出,食品卫生标准分委员会审查通过。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所起草。
本标准主要起草人王光亚、周瑞华。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
中华人民共和国卫生部队1990-03-19 1990-12-01实施
