细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。
（一）细菌染色的一般程序
细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脱色）—（复染）。
1．涂片制备
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。
2．固定
目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。
3．染色
根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。
4．媒染
凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5．脱色
凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
6．复染
已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。
（二）常用染色法（染液配方见第8章）
单染色法
只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。
2．复染色法
用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
（1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。
（2）抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。持续染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干。②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。
金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30~90s。②弃去第1液后加第2液染15min。③用第3液脱色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。
3．特殊染色法
（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸馏水1滴。③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果 鞭毛和菌体呈紫色。
（2）异染颗粒染色(阿尔培托法)：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。
（3）荚膜染色：①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。
（4）芽胞染色：染液：第一液为萋－纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min，冷却后水洗。用第二液脱色2min，水洗。加第三液复染1min，水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
4．负染色法
背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法，用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。
5．荧光染色法
经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。
