出口肉中丙硫咪唑残留量

中华人民共和国进出口商品检验行业标准
SN 0207-93 检 验 方 法
Method for determination of albendazole residues in meat for export

1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口肉中丙硫咪唑残留量检验的抽样、制样和高压液相色谱测定方法。
本标准适用于出口猪肉中丙硫咪唑残留量的检验 。
2 抽样和制样
2.1 检验批 以不超过2500件为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2 抽样数量 检验批中的件数
最少抽样件数 1～25 1 26～100 5 101～250 10 251～500 15 501～1 000 17 1001～2500 20
2.3 抽样方法 按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样 品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后,标明标记,及时送实验室。
2.4 试样制备 从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎 均匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于500g ,装入洁净容器内,加封后,标明标记。
2.5 试样保存 将试样于-18℃冷冻保存。
注：在抽样和制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3 测定方法
3.1 方法提要 2.5g均匀试样于6N HCl中水解,用碳酸钠调节pH≥8.0,用乙酸乙酯提取。将丙硫咪 唑代谢物和内标反提取到1N HCl内。于Sep-Pak柱中净化后,浓缩至干,残渣重新溶解于流动相中,用具荧光检测器的HPLC进行定量。
3.2 试剂和材料
3.2.1 5-(丙硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：标准品。纯度＞99%。
3.2.2 5-(丁硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：内标。纯度＞99%。
3.2.3 浓盐酸：分析纯。
3.2.4 二甲亚砜(DMSO)：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.5 乙酸乙酯：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.6 甲醇：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.7 甲苯：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.8 乙腈：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.9 二乙醇胺。
3.2.10 无水碳酸钠：粉末状,分析纯。
3.2.11 磷酸二氢钾：分析纯。
3.2.12 无水磷酸氢二钾：分析纯。
3.2.13 水：去离子水。
3.2.14 氮气：纯度≥99.99%。
3.2.15 标准储备溶液
3.2.15.1 称取10.0mg5-(丙硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内,用DMSO溶解并稀释至刻度(100μg/mL)。
3.2.15.2 称取10.0mg5-(丁硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内,用DMSO溶解并稀释至刻度(100μg/mL)。
3.2.16 标准工作溶液
3.2.16.1 移取2.0mL储备溶液(3.2.15.1)及8.0mL DMSO 入一15mL具玻塞离心管内,以涡式混匀器混匀,制得20μg/mL溶液(3.2.16.1)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相当于400μg/kg)。
3.2.16.2 移取5.0mL工作溶液(3.2.16.1)及5.0mL DMSO 入一15mL具玻塞离心管内,以涡式混匀器混匀,制得10μg/mL溶液(3.2.16.2)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相当于200μg/kg)。
3.2.16.3 移取5.0mL工作溶液(3.2.16.2)及5.0mL DMSO 入一15mL具玻塞离心管内,以涡式混匀器混匀,制得5μg/mL溶液(3.2.16.3)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相当于100μg/kg)。
3.2.16.4 移取1.0mL储备溶液(3.2.15.2)及9.0mL DMSO 入一15mL具玻塞离心管内,以涡式混匀器混匀,制得10μg/mL溶液(3.2.16.4)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相当于200μg/kg)。 所有标准溶液均应保存于冰箱内,标准在DMSO溶液中至少可以稳定6个月。因为在此条件下DMSO会发生凝结,所以使用前需要将离心管放于装有温水的烧杯内,使标准溶 液重新液化,以涡式混匀器混匀。
3.3 仪器和设备
3.3.1 液相色谱仪并配备荧光检测器。
3.3.2 微量注射器：10μL,50μL。
3.3.3 保护柱：CO:PELL ODS,2mm(内径)×5cm。
3.3.4 微孔过滤器：0.2μm,0.45μm滤膜。
3.3.5 玻璃刻度离心管：具磨口塞,15ml。
3.3.6 离心机。
3.3.7 岛碎机。
3.3.8 吸移管。
3.3.9 pH计。
3.3.10 涡式混匀器。
3.3.11 真空抽滤器。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取和净化
3.4.1.1取试样代表性部位,以捣碎机进行充分匀化。匀化后的试样在分析前一直冷冻保存。3.4.1.2 将一去皮重的烧杯置于天平上,烧杯中放一50mL玻璃离心管(未加塞),用粗管尖吸移管取样,称取2.5±0.05g均匀试样,置于离心管底部。如此分别制备四份空白组织试样,及一份对照试样,三份添加标准的试样。在对照试样中加入100μL纯DMSO。在疑有丙硫咪唑残留物的组织试样中加入50μLDMSO。在空白组织试样和疑有丙硫咪唑的组织试样中分别加入50μL工作溶液(3.2.16.4)。然后,在已加入50μL工作溶液(3.2.16.4) 的三个空白组织试样中分别加入50μL工作溶液(3.2.16.1)、(3.2.16.2)、(3.2.16.3)。 注：应将添加溶液加于50mL管内刚好浸没均匀试样,以便下一步加入HCl时确保有足 够的溶液。
3.4.1.3. 在3.4.1.2制备的每一试样中加入2.5ml 6N HCl,盖好每支管,然后将试样管(用另一试管架固定,以防塞子突然跳出)放到预先调至110±4℃的烘箱内。
3.4.1.4 在1h后,把试样从110±4℃的烘箱中取出,将试样管放于干冰或冰上约5min,冷却至室温。
3.4.1.5 向每个试样中加入2.0mL水,然后以涡式混匀器混匀试样,用pH计监测pH值。慢慢加入足量(约1.23g)的碳酸钠,加入时间约需4～5min,以免起泡或结块,调节pH至8～ 9.5(将洁净的pH电极直接放入试样中测定。记录pH值后,在离心管内壁上轻轻接触去掉 电极上的液滴。将整个电极从试样管中取出,用水冲洗,擦干后再测定下一个试样。) 注：室温或接近室温的试样,加入碳酸钠时象较冷试样那样不会产生泡沫,因此,加 入碳酸钠时可以快些。
3.4.1.6 向每个试样内加入15mL乙酸乙酯,盖上塞子,平放于试管架上,振摇5min。然后取下塞子,于约4000r/min将试样离心5min。
3.4.1.7 用吸移管将乙酸乙酯提取液转入另一50mL玻璃离心管内,应尽量转移完全。注意不要带走水相。
3.4.1.8 重复操作3.4.1.6和3.4.1.7步骤,再次提取每个试样,把相应的提取液合并于各自的50mL玻璃离心管内。
3.4.1.9 向每个合并的乙酸乙酯提取液中加入4.0mL 1 N HCl,盖上塞子,平放于试管架上,振摇5min。取下塞子,然后于4 000r/min左右离心5min。
3.4.1.10 尽量完全吸去乙酸乙酯相,注意不要带走水相。在35±5℃水浴上蒸去水溶液上残留的乙酸乙酯(＜1mL)。(必要时,可在此步骤停止分析操作,而放置过夜。)
3.4.1.11 以涡式混匀器将每一试样混匀,同时慢慢加入足量(约0.33g)碳酸钠,加入时间约需1～2min,以免起泡或结块。用pH计监测pH值,每个试样的pH值应为8～9.5。
3.4.1.12 向每个试样中加入20mL甲苯,盖上塞子,平放于试管架上,振摇5min,取下塞子,于4 000r/min左右将试样离心5min。
3.4.1.13 尽量完全吸去甲苯相,注意不要带走水相。在35±5℃的水浴上蒸去水相上残留的甲苯(＜1mL)。(必要时可在此步骤停止分析操作,而放置过夜。)
3.4.1.14 对于每一个试样,相对应将一10mL玻璃注射器(圆柱形推液塞要取下)用夹子固定在环形架上。注射器的路氏接头前端连接SEP-PAK C18柱体。
3.4.1.15 将每支柱用2mL甲醇预洗,而后用2mL0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤。加入每种试剂后,经过安装于注射器顶部的橡皮塞缓缓通入氮气,利用氮气压力使试 剂穿过柱体。当氮气开始出柱时即停气。氮气流速约1～2ml/min。弃去洗脱液。
3.4.1.16 从步骤3.4.1.13中得到的每一试样水相转入预先洗涤好的各注射器柱系统内。用步骤3.4.1.14的方法,应用氮气使溶液流经柱体洗提,然后各取每一试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀),使用巴氏吸移管采用类似方法将水洗液分别转入各注射器柱系统内,弃去洗脱液。
3.4.1.17 再取每个试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀),分别转入各注射器柱系统内,按步骤3.4.1.15的方法应用氮气使此水洗液流经柱体洗提,弃去洗脱液。
3.4.1.18 向每一注射器柱系统内分别加入2mL甲苯,按步骤3.4.1.15的方法用氮气使甲苯流经柱体洗提,弃去洗脱液。
3.4.1.19 在每一注射器柱系统下面分别放置一15mL离心管,向每个柱系统内加入2mL乙酸乙酯,按步骤3.4.1.15的方法用氮气使乙酸乙酯流经柱体进行洗脱。在这部分洗脱 液中含有待测化合物。
3.4.1.20 向步骤3.4.1.19中得到的每份洗脱液中分别加入约0.5mL甲醇,以涡式混匀器混匀,以得到均匀的溶液。
3.4.1.21 于35±5℃的水浴上在干燥氮气下将步骤３.4.1.20得到的洗脱液浓缩至干。
3.4.1.22 至干后,加入0.5mL水－甲醇溶液(70＋30),以涡式混匀器混匀,重新溶解残渣。 3.4.1.23 30min后,将每个重新溶解的试样加入微量过滤装置内,采用0.2μm再生纤维素滤膜过滤。然后将每个过滤器及试样提取液于4 000r/min左右离心5～10min。
3.4.1.24 将滤液转入15mL具塞玻璃离心管内,用水－甲醇(70＋30)调节每一滤液体积为0.5mL。使用硅烷化管有助于将提取液浓缩于管的底部。以涡式混匀器混匀后移取0.1mL供HPLC分析。
3.4.2 测定
3.4.2.1 液相色谱条件
a.色谱柱：μBondapak C18柱,30cm×3.9mm内径 ；
b.流动相：68%0.02M KH2PO4 : 0.01M二乙醇胺(200mL0.1 M KH2PO4＋1.05g二乙醇胺,加水至1L)； 20%甲醇； 12%乙腈。 该溶液当日新配,使用前用0.45μm滤膜,并用真空系统抽气。
c.流速：18mL/min；
d.温度：室温。
3.4.2.2 色谱测定 先将激发波长和发射波长分别调节在300nm和320nm,狭缝宽度≤10nm。设置合理的基线灵敏度,注入适量试样(20μL),然后观察标准和内标响应峰的强度。若需更好的灵敏度,则进行如下步骤： 在观察检测器吸收响应时,在5nm以内调节激发波长,以减小本底零值。如上再次进样,确定欲测化合物的信号响应是否增加。按此程序继续选择最佳激发波长和发射波长,直至得到合适的分析信噪比(s/n≥25/1)。 在上述条件下,其保留时间：丙硫咪唑代谢物约4.3min,内标约7.0min。
3.4.3 结果计算 若没有积分仪,则可以用峰高值和峰高比来代替下面所讨论的峰面积和