中华人民共和国商业部部标准
SB 115-82 代替SB 3306-66
本标准适用于冰蛋品的肠道致病菌大肠菌群及细菌数的检验。
1 取样方法
1.1 批的划分 以接触蛋液的工具、设备彻底消毒一次时的生产数量为一批。巴氏消毒的冰蛋可按 生产量的大小每隔1～4小时奖巴氏消毒器冲洗消毒一次,每两次冲洗之间,按顺序划为2～4批,如发现致病菌时,本批即不合格,前面的批可不受牵连,后面的批予以复验,按复验结果处理。
1.2 采样数量 按生产批号,在装听时流动取样。
1.2.1 检验肠道致病菌时,分蛋(冰鸡蛋黄、冰鸡蛋白)及冰鸡全蛋,取样按每250公斤取样一次,量约100克,每500公斤取样二次,合为一个检样；巴氏消毒冰鸡全蛋取样按500公斤取样一次,每1000公斤取样二次,合为一个检样。
1.2.2 检验细菌数、大肠菌群时,在每批装听过程前、中、后流动取样,每批合为一个检样。
1.3 用具
a. 电钻与钻头；
b. 玻璃漏斗或铝制漏斗；
c. 密封式250克敞口玻璃瓶。
注：上项用具在使用前应在160～180℃ 的温度下干燥消毒2小时。抽样钻头每抽取样品一批后应以75％酒精进行浸泡消毒。
1.4 方法
1.4.1 在生产过程中灌取流动样品的敞口扦样瓶(罐),随该批产品入冷冻室,冷冻完毕后作细菌检验使用。
1.4.2 成品钻样时,先将铁听开口处的外部用75％的乙醇进行消毒,而后将盖启开,用电钻由顶至底斜角钻入,徐徐钻出样品,然后抽出电钻,就中取约200克于扦样瓶(罐)中,封实后准备检验。
2 检验方法
2.1 肠道致病菌的检验
2.1.1 试样制备：将盛冰蛋的样品瓶浸泡冷水中(谨慎小心,勿使水浸入瓶内)使样品融化后取出,充分摇和均匀。
2.1.2 增菌培养：以无菌操作,由每瓶样品中采取一个试样,接种于亚硒酸盐煌绿增菌培养基中(此培养基预先置于盛有约30粒3～4毫米直径玻璃珠的灭菌玻璃瓶内)盖紧瓶盖,振荡均匀,使检样与培养基充分溶和,然后放入37℃定温箱中培养18～24小时。培养基数量及样品数量按表1规定：
表 1
培 养基 名 称 接种试样数量 培养基数量
亚硒酸盐煌绿 30克 150毫升
2.1.3 分离培养:经过增菌后,接种于远藤氏或伊红美蓝培养基一个,及去氧胆酸盐枸橼酸盐或S·S琼脂培养基一个,置37℃培养箱中,对鉴别培养基培养24小时,对选择性培养基培养48小时,然后观察结果。如无可疑菌落即可做阴性结果的报告,如有可疑菌落则在每个平皿上挑取2～3个菌落接种于三醣铁琼脂斜面培养基上,再于37℃培养箱中培养18～24小时,然后按表2作初步鉴定。
三醣铁琼脂斜面培养基反应与鉴别见表2:
表 2
反 应 鉴 别
底 层 斜 面 硫 化 氢 非沙门氏菌属及志贺氏菌属
(可作为报告的依据)
○＋ ＋ ＋
○＋ ＋ －
＋ ＋ －
－ － ＋
－ － －
＋ － ＋ 可疑为沙门氏菌属
○＋ － ＋
○＋ － －
＋° － － 可凝为沙门氏菌属及志贺氏菌属
＋ － －
注:○＋表示产酸产气反应。 ＋°表示微量产酸产气反应。＋表示产酸或产硫化氢。－表示不产酸不产气,不产硫化氢
2.1.4 生化及血清学鉴定。
2.1.4.1 生化试验:
三醣铁琼脂斜面培养基属可疑沙门氏菌属的反应者,则可再行接种一套生化试验(也可以先进行血清凝集试验)：属可疑志贺氏菌属的反应者,先进行血清凝集试验,必要时再进行生化试验,其反应如表3。
沙门氏菌属生化反应与鉴别见表3:
表 3 项 目 反 应
硝 酸 盐 还 原
尿 素 不 分 解
靛 基 质 不 产 生
乳 糖 不 发 酵
甘 露 醇 发 酵
蔗 糖 不 发 酵
水 杨 素 不 发 酵
注:① 醣类发酵阴性反应者,应观察14日始得报告阴性
② 上列各项生化试验应同时进行接种。
志贺氏菌属反应与生化鉴别见表 4:
表 4 项 目 甘露醇 鼠李糖 木胶糖 乳 糖 靛基质
菌 别
志贺氏痢疾杆菌 － － - - -
史氏痢疾杆菌 － ＋ - - ＋
宋氏痢疾杆菌 ＋ + - ＋迟 -
福氏痢疾杆菌 ＋－ - - - －＋
注：① “＋”为阳性反应,“－”为阴性反应。
② 醣发酵阴性反应者,应观察14日始得报告阴性。
2.1.4.2 血清凝集试验:
a. 经表3生化试验而符合于沙门氏菌属的特性者,最后则进行血清学鉴定,即以沙门氏菌属多价诊断血清进行玻片凝集试验。
b. 玻片凝集试验,挑取在三醣铁琼脂斜面培养基中,疑似沙门氏菌落于洁净玻片的血清滴上,充分混合,使成乳液后,视其有无凝集现象,未见凝集发生者,可作阴性结果报告。如凝集细小不易辩别时,可用放大镜或低倍显微镜进行观察,为避免细菌有自凝现象起见,可在玻片另侧另加生理盐水作对照试验。
c. 如沙门氏菌多价血清有凝集现象者,则报告发现或检出沙门氏菌属,如必要分型者,则再行单价因子血清凝集及鞭毛因子血清凝集以确定其型别。
d. 在三醣铁琼脂斜面培养基中,疑似志贺氏菌属反应者,以志贺氏多价血清作凝集,凝集阳性时报告发现志贺氏菌属,必要时可以进行单价诊断血清鉴定,及生化试验以确定 其属宋氏、福氏或史氏痢疾杆菌。
e. 结果的判断与报告方法：
(a) 沙门氏菌属： 生化试验及血清学鉴定结果均符合沙门氏菌属之特点时,即报告为“发现沙门氏菌 属”。 生化试验结果符合沙门氏菌属的生化特性而血清学鉴定为阴性时,再进行“KCN试验”,如仍符合时,则报告“发现沙门氏菌属——未鉴定”,如不符合则报告为“未发现沙门氏菌属”。 凡生化试验及血清学鉴定结果均不符合者,则报告为“未发现沙门氏菌属”。生化试验不符合者,应根据下列不同情况报告： 尿素或硝酸盐还原试验不符合者即可报告为“未发现沙门氏菌属”乳糖、蔗糖、水杨素、甘露醇及靛基质反应有两种或两种以上不符合者,即报告为“未发现沙门氏菌属”。靛基质试验阳性者或乳糖、蔗糖、水杨素任一种在两天或两天以上发酵或甘露醇反 应不符合者,则以单因子血清及其他生化试验作最后鉴定。
(b) 志贺氏菌属: 经血清学鉴定和生化试验为阳性者即报告为“发现志贺氏菌属”。血清学鉴定为阴性者,即报告为“未发现志贺氏菌属”。
2.2 细菌数检验法(平板培养数菌法)：
2.2.1 稀释及培养：
a. 以无菌手续充分摇动拌匀,以无菌吸管或玻管吸取均匀蛋液10～15克于250毫升无菌的玻璃瓶中(瓶内预先置入直径3～4毫米玻璃珠30粒左右),于每瓶中加入相当试样重 量9倍的灭菌生理盐水作成十倍稀释液,盖紧瓶盖以振荡均匀,使成乳剂。
b. 用1毫升灭菌吸管(1/10毫升刻度到尖端)吸取上项稀释液１毫升,注入预先备好的一列灭菌试管(每管内均盛有灭菌生理食盐水9毫升)的第一管中,作成百倍稀释液(此液需用该吸管吐数次使之混和均匀),然后再以该吸管吸取百倍稀释液1毫升注入预先备好的灭菌二重皿中,同样共接种二重皿三个。
c. 以另一灭菌吸管,由百倍稀释液中吸取1毫升加入预先备好的一列灭菌试管的第二管中,依上述方法作成千倍稀释液,并接种二重皿三个。
d. 依同法作成万倍十万倍五十万倍等稀释液(可根据具体情况作成适宜的稀释液3个,每个3列),并皆按上法进行接种,然后于每只二重皿内倾入已溶化的约45℃普通琼脂培养 基pH7.0(此培养基溶化后预置入45℃恒温水浴锅内)15～20毫升,轻轻转动二重皿,使培养基与稀释液混合均匀后静置不动。 e. 将上项作成的二重培养皿,等其凝固后,以皿底在上皿盖在下的倒置方式放入37℃培养箱中。
2.2.2 数菌法：
a. 以上项平板培养于48小时取出,选择其菌落在 30～300之间者为准,即以该稀释倍的三个平板培养分别计算其菌落数。
b. 将上项所得的三个平皿的菌落数,平均再乘以该稀释倍数,即得出该样品每克所含细菌数
2.2.3 报告法：
a. 按平板培养数菌法,检出1克中所含菌数以百或千为尾数作报告。 b. 应注明在37℃经48小时平板培养数菌法检查的结果。
2.3 大肠菌群检验法
2.3.1 稀释及培养：
a. 在进行前项菌数培养的同时,依次选择三种不同稀释液各取1毫升分别接种于乳糖胆盐发酵管中,对每种稀释液均作三列培养。
b. 将上项已接种的发酵管,轻轻摇动使混合均匀,然后一并置35～37℃培养箱中培养24±2小时。
2.3.2 结果的判断及报告方法：
a. 如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为“大肠菌群阴性”。
b. 如产气者,将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝平板(也可采用远藤氏琼脂平板或麦康凯琼脂平板)上,置35～37℃培养箱内,培养18～24小时,然后取出。在上述平板上挑取大肠菌群可疑菌落1～2个进行革兰氏染色镜检,同时接种乳糖复发酵管,置35～37℃培养箱内,培养24±2小时,观察气产情况。
c. 凡乳糖复发酵管产气,革兰氏染色为阴性,无芽胞杆菌,即可报告为“大肠菌群阳性”；如乳糖不产气或革兰氏染色阳性,则报告“大肠菌群阴性”。
2.3.3 查表:根据证实为大肠菌群阳性的管数,按表5报告大肠菌群最近似数。每100毫升(克)检样中大肠菌群最近似数(M.P.N.)检索表
表 5
检 样 量 大肠菌群最近
似数个/100毫升(克)
10毫升(克)×3 1毫升(克)×3 0.1毫升(克)×3 0.01毫升(克)×3
0 0 0 0 0 1 2 3 0 3 6 10
1 1 1 1 0 1 2 3 4 7 12 16
2 2 2 2 0 1 2 3 9 15 20 30
3 3 3 3 0 1 2 3 25 45 110 250
0 0 0 0 0 1 2 3 0 30 60 100
1 1 1 1 0 1 2 3 40 70 120 160
2 2 2 2 0 1 2 3 90 150 200 300
3 3 3 3 0 1 2 3 250 450 1100 2500
0 0 0 0 0 1 2 3 0 300 600 1000
1 1 1 1 0 1 2 3 400 700 1200 3000
2 2 2 2 0 1 2 3 900 1500 2000 3000
3 3 3 3 0 1 2 3 2500 4500 11000 25000
注:表若不够用时,可依此类推。
3 培养基制备和血清生化试验
3.1 培养基制备法
3.1.
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