中华人民共和国国家标准
A GB 13111-91
Method for determination of ochratoxin A in cereal and bean
1 主题内容与适用范围
本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。
本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定。
在薄层板上赭曲霉毒素A的最低检出量为4ng。本方法的最低检测量为10 μg/kg。
2 原理
用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取 液经液-液分配后，根据其在365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。
3 试剂
以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。
3.1 石油醚(60～90℃或30～60℃)。
3.2 甲醇。
3.3 三氯甲烷。
3.4 甲苯。
3.5 乙酸乙酯。
3.6 甲酸。
3.7 冰乙酸。
3.8 乙醚。
3.9 苯-乙腈(98：2)。
3.10 0.1mol/L磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸(85%)加水稀释至1000mL。
3.11 2mol/L盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]：量取20 mL盐酸，加水稀释至120mL。
3.12 4%氯化钠溶液。
3.13 0.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1mol/L]：称取8.4g碳酸氢钠,加适量水溶解， 并用水稀释至1000 mL。
3.14 硅胶G：薄层层析用。
3.15 赭曲霉毒素A(以下简称OA)标准溶液：用苯-冰乙酸(99：1)配成40 μg/mL赭曲霉毒素A贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照GB 5009.22《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中2.14条(赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333 nm，分子量403，克分子消光系数值为5550)。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素A0.5μg，赭曲霉毒素A标准液应置冰箱中避光保存。
4 仪器
所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水，蒸馏水冲洗。
4.1 小型粉碎机。
4.2 电动振荡器。
4.3 玻璃板：5cm×20cm。
4.4 薄层涂布器。
4.5 展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。
4.6 紫外光灯：365 nm。
4.7 微量注射器：10μL、50μL 。
4.8 具0.2mL 尾管的 10 mL，小浓缩瓶。
5 分析步骤
5.1 提取
5.1.1 甲法
称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL三氯甲烷和10mL 0.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤；取20ml，滤液置于250mL分液漏斗中,加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min,静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中)，加入50mL 0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约5.5mL 2mol/L盐酸溶液调节 pH2～3(用pH试纸测试)，加入25mL三氯甲烷振摇 2min，静置分层后,放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中,酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层,用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75ml蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中,置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(N2),浓缩至干,加入0.2mL苯-乙腈(98：2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用。
5.1.2 乙法
称取20g粉碎并通过20目筛的样品加于200mL具塞锥形瓶中,加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55：45),在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后,取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为pH5～6。加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中,再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烷振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醇促使其分层)，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入50～100mL 4%氯化钠溶液(加入量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右),振摇放置(如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品须再加入10mL三氯甲烷振摇,三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中),将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。
以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。
5.2 测定
5.2.1 薄层板的制备
称取4g硅胶G,加约10mL水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成5cm×20cm, 厚度0.3mm的薄层板三块,在空气中干燥后,在105～110℃活化1h，取出放干燥器中保存。
5.2.2 点样 取两块薄层板，在距薄层板下端2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左边缘1.7cm处滴加OA标准溶液8μL(浓度0.5μg/mL),在距板左边缘2.5cm处滴加样液25μL,然后在第二块板的样液点上加滴OA标准溶液8μL(浓度0.5μg/mL)。点样时,需边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。
5.2.3 展开
5.2.3.1 展开剂
横展剂：乙醚或乙醚-甲醇-水(94：5：1)。
纵展剂：
a.甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6：3：1.2：0.06)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (6：3：1.4)； b.苯-冰乙酸(9：1)。
5.2.3.2 展开
横向展开：在展开槽内倒入10mL横展剂，先将薄层板纵展至离原点2～3cm，取出通风挥发溶剂1～2min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展,如横展剂不够，可添加适量，展至板端过1min，取出通风挥发溶剂2～3min。
纵向展开：在另一展开槽内倒入10mL纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13～15cm。取出通风挥干至板面无酸味(约5～10min)。
5.2.4 观察与评定
将薄层色谱板置365nm波长紫外光灯下观察。
a.在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则样品中的OA含量在本测定方法的最低检测量10μg/kg以下。
b.如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。
5.2.5 稀释定量
比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。
薄层板经双向展开后，当阳性样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了，这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概略定量。
5.2.6 确证试验
用碳酸氢钠乙醇溶液(在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠,加20mL乙醇)喷洒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，再估计样品中OA，如果与喷洒前情况不一致，要利用喷洒前所做的估计。
6 计算
样品中赭曲霉毒素A的含量可按下式计算。
V1 1000
x= A × ━━ × D × ━━━
V2 m
式中 x──样品中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg;
A─-薄层板上测得样液点上OA的量，μg;
D──样液的总稀释倍数；
V1─-苯-乙腈混合液的体积，mL；
V2──出现最低荧光点时滴加样液的体积，mL；
m─-苯-乙腈溶解时相当样品的质量，g。
7 精密度
本方法经五个协作者验证，在OA加入量分别为10,50,100μg/kg水平、每个水平n=2时，方法的回收率用X表示、精密度用SD表示：
小麦分别为 93±10.23；92±14.72；105±38.85。
玉米分别为88±9.68;88±9.68;103±41.2。[上述数据为(X±SD)%]
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、黑龙江省食品卫生监督检验所、北京市卫生防疫站、山西省卫生防疫站负责起草。
本标准主要起草人魏润蕴、鲍凤珍、方晓明、杨貌端、高晓岚。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
中华人民共和国卫生部1991-06-07批准 1992-03-01实施
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