高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。一. 在食品分析中的应用
1．食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；
2．食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；
食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。
二. 在环境分析中的应用
多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。
三. 在生命科学中的应用
HPLC技术目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。其在生化领域的应用主要集中于两个方面：
1. 低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。
2. 高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。
过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感性趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。
四. 在医学检验中的应用
体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：
1. 合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。
2. 天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等
五．在无机分析中的应用
阳、阴离子的分析等。
