摘要:目的:探讨冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响.方法:将大肠杆菌用10%的甘油溶液制成菌悬液，分成3组，测定各组菌种的活菌数，同时置-20℃冷冻处理.3组分别被冻融处理1、2、3次.测定冻融处理后、冻存1年及2年各组的活菌数.结果:随着冻融次数的增加，冻融处理后，冻存1年及2年的活菌数均明显降低，冻融次数越多，细菌存活率越低
结论:反复冻融会降低菌种的存活率.
中图分类号:R378.21; Q93-336
微生物菌种的保存方法因微生物种类不同而有所不同，国内外对此有较多的报道[1～3].甘油保存法是生产中常用的方法之一.在甘油保存菌种过程中，细胞内外形成的冰晶会对细胞造成结构上的损伤，从而影响菌种的存活率.本文主要探讨了反复冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响.为制药和微生物工作者提供具有参考价值的数据.
1.材料
大肠杆菌PJLA605-HIL2.
LB固体培养基:胰蛋白胨(英国Oxoid)10 g、酵母抽提物(英国 Oxoid)5 g，氯化钠10 g，溶解并定容至1 000 ml，调pH至7.2，固体培养基加2%琼脂.
2.方法和结果
2.1大肠杆菌培养
将待分离的菌种划LB平板，以取得单菌落，经模拟发酵选出优良菌种，将此菌种接到LB斜面上，30℃，培养24 h.
2.2大肠杆菌冻存
用10%甘油溶液洗下培养好的菌种，并在无菌小烧杯中混匀，制成浓度为1×108个/ml的菌悬液，然后分装到eppendorf管中，每支eppendorf管加菌液1 ml，将此菌种分成3组，编号1、2、3，然后放入-20℃冰箱中保存.
2.3二次冻存
将2.2项中的第2、3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃的水浴锅中融化，然后再放入-20℃冰箱冻存.
2.4三次冻存
将2.3项中的第3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃的水浴锅中融化，然后再放入-20℃冰箱冻存.
2.5存活率的测定
采用平板菌落计数法.取LB平板9套，每3套为一组，在每组皿底分别标明10-7、10-8、10-9，再取9个2 ml西林瓶，依次标明10-1、10-2、10-3……10-9，并向西林瓶中各加入无菌水0.9 ml.
用微量取样器精确吸取第1组菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.将10-1西林瓶内的菌液混匀，即成10-1稀释液.再从10-1西林瓶中取稀释液0.1 ml注入10-2西林瓶中，重复上述操作，直至制成10-7、10-8、10-9稀释液.
分别精确取10-7、10-8、10-9稀释液0.1 ml注入对应的LB平板内，用玻璃涂布器涂布均匀，于30℃培养24 h后，数各皿中的菌落数，计算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数，根据菌落数计数活菌数.
用同样步骤可计算出冷冻前3组菌液的活菌数，见表1.
在冷冻后及冷冻后1年、2年分别将3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃水浴锅中融化，用平板计数法测定活菌数，计算菌种存活率，如表1.
3.讨论
在冷冻保存菌种时加入甘油作保护剂，虽然可以提高菌种的存活率，但冻融还是会造成菌体结构上的损伤.菌种每冻融一次，其存活率都会明显下降，经处理后的菌种保存1年或2年后，冻融次数越多，其存活率越低.因此，为使菌种有较高的存活率，不宜反复冻融.生产用甘油菌种一般保存1年，对1年后的菌种就要对其筛选活化后再用.
参考文献
1，王亚珍.乳酸杆菌的保藏方法.生物技术，1998，8(1)∶41～42
2，李广武，郑从义，唐兵.低温生物学.长沙∶湖南科学技术出版社，1998∶130～131
3，中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编著组.菌种保藏手册.北京∶科学出版社，1980∶649～652
