一、概要
用来检测呋喃唑酮代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用AOZ衍生物的特异性抗体，具有很高的准确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。（本试剂盒的检测时间为1.5小时。）
二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留的AOZ经衍生化后和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物AOZ的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃唑酮代谢物的残留量。
三、适用范围
可定性、定量检测动物组织（鸡、猪、牛等）、牛奶、蜂蜜和鸡蛋样本中的呋喃唑酮代谢物的残留量。
四、交叉反应率
呋喃唑酮代谢物…………………………………… 100%
呋喃它酮代谢物…………………………………小于 0.1%
呋喃妥因代谢物…………………………………小于 0.1%
硝基糠腙（呋喃西林）代谢物…………………小于0.1%
呋喃唑酮…………………………………………………16.3%
呋喃它酮………………………………………………小于1%
呋喃妥因………………………………………………小于1%
硝基糠腙（呋喃西林）………………………………小于1%
五、使用单位需自备的设备及试剂
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置
┅┅均质器
┅┅振荡器
┅┅涡旋仪
┅┅离心机
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶： 100ml、1L
┅┅玻璃试管：10ml
┅┅聚苯乙烯离心管：2ml、10ml、50ml
┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
试剂：
┅┅乙酸乙酯（分析纯）
┅┅正己烷（或正庚烷）（分析纯）
┅┅三水合磷酸氢二钾（分析纯）
┅┅浓盐酸
┅┅氢氧化钠（分析纯）
┅┅二水合亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析纯）（供奶、鸡蛋样用）
┅┅七水合硫酸锌(ZnSO4·7 H2O) (分析纯)（供奶、鸡蛋样用）
┅┅去离子水
六、提供的材料与试剂
1、96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）
2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，0.05ppb，0.15ppb，0.45ppb，1.35ppb，4.05ppb 3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 100ppb
4、酶标二抗浓缩液 1.5ml …………………… 红色帽
5、抗体浓缩液 0.8ml……………………绿色帽
6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液 7ml …………………… 红色帽
8、终 止 液 7ml …………………… 黄色帽
9、20×浓缩洗涤液 40ml………………………透明帽
10、2×浓缩复溶液 50ml……………………蓝色帽
11、2-硝基苯甲醛 15.1mg……………………黑色帽
七、溶液的配制
配液1: 衍生化试剂
向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至10ml（浓度为10mM）。
配液2: 0.1M磷酸氢二钾溶液
称取22.8g三水合磷酸氢二钾加去离子水溶解定容至1L。
配液3: C液（供奶样、鸡蛋用）：
0.36M亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
称取10.7g 亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100ml
D液（供奶样、鸡蛋用）：
1M硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液
称取28.8g 硫酸锌用去离子水溶解定容至100ml
配液4: 1M盐酸溶液
量取8.3ml浓盐酸加入到盛有去离子水的容器中定容至100ml。
配液5: 1M 氢氧化钠溶液
称取4.0g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml。
配液6: 复溶工作液
用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于抗体浓缩液、酶标二抗浓缩液的稀释及提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。
配液7: 洗涤液工作液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
八、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）衍生化试剂可于2-8℃保存半年。
（d）磷酸氢二钾溶液可于2-8℃保存三个月
（e）盐酸溶液可于室温保存三个月
（f）氢氧化钠溶液可于室温保存三个月
（g）未处理的样本冷冻保存。
（h）处理好的样本可在2-8℃避光保存24小时。
（i）鸡蛋样本前处理过程中，50℃水浴2小时，中间每半小时必须用振荡器剧烈振荡1-2分钟，它直接影响结果的准确性。
（一）肌肉、肝脏组织前处理方法
┅┅用均质器均质样本；
┅┅接(四)的描述方法。
注：样本应当在阴凉避光处冷藏保存
（二）牛奶前处理方法
┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；
┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中；
┅┅分别加入250ml C液和250ml D液（见配液3）；
┅┅用振荡器充分振荡混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）离心10min。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8 oC（46℉），然后离心；
┅┅接(四)的描述方法
（三）蜂蜜前处理方法
┅┅称取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；
┅┅用4ml去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；
┅┅加入0.5ml 1M盐酸溶液（见配液4）和100ml衍生化试剂（见配液1），用振荡器充分振荡；
┅┅接(四)第二步描述方法（标 * 处）。
（四）接上面的方法
┅┅称取1.0±0.05g均质后的组织样本（肝样/肉样）、制备好的牛奶样本上清液1.1ml（相当于1ml的奶样），分别加入4ml的去离子水、0.5ml 1M 盐酸溶液（见配液4）和100ml衍生化试剂（见配液1），用振荡器充分振荡2min；
*┅┅在37 oC过夜孵育（大约16h）；
┅┅分别加入5ml 0.1M 磷酸氢二钾溶液（见配液2）、0.4ml 1M 氢氧化钠溶液（见配液5）和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s；
┅┅3000g以上，室温（20-25 oC/68-77℉）离心10min；
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液（见配液6），用涡旋仪涡动1min充分混匀；
┅┅3000g以上，室温（20-25 oC/68-77℉）离心10min；
┅┅除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析。
（五）鸡蛋前处理方法
┅┅用均质器低速均质样本(蛋黄或全蛋)；
┅┅称取2.0±0.05g均质过的蛋样本至10ml聚苯乙烯离心管中，分别加入4ml去离子水、0.5ml 1M 盐酸溶液（见配液4）、200μl C液（见配液3），用振荡器振荡1min混匀；
┅┅加入200μl D液（见配液3），用振荡器充分振荡5min，3000g以上，室温（20-25 oC/68-77℉）离心10min；
┅┅取全部上清液至15ml聚苯乙烯离心管中，加入200μl衍生化试剂（见配液1），用振荡器充分振荡，50℃水浴2h（中间每半小时用振荡器剧烈振荡1-2分钟）；
┅┅分别加入5ml 0.1M 磷酸氢二钾溶液（见配液2）、0.4
