一、概要
本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，操作时间仅需1.5小时，能最大限度地减少工作强度和操作误差。
二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三者的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中磺胺类药物的残留量。
三、适用范围
可定性、定量检测动物组织（肌肉/肝脏/鱼/虾）、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清等样品中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）药物的残留量。
四、交叉反应率
磺胺嘧啶（SD或SDZ）…………………………… 100.0%
磺胺间甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）…… 98%
磺胺甲噁唑（SMZ）………………………………… 120.0%
磺胺噻唑（ST）……………………………………… 98.0%
酞酰磺噻唑（PST）………………………………… 62.8%
磺胺甲噻二唑…………………………………… 103%
磺胺吡啶…………………………………………… 51.9%
磺胺对甲氧嘧啶…………………………… 35%
五、使用单位需自备的设备及试剂
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置
┅┅均质器振荡器、洗耳球、容量瓶：500ml
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅玻璃试管：15ml
┅┅聚苯乙烯离心管：50ml
┅┅玻璃离心管：10ml
┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、200ml～1000ml
多道 250ml
试剂：
----乙腈(分析纯)（动物组织专用）
----乙酸乙酯(分析纯)
----正己烷(分析纯)
----十二水合磷酸氢二钠(分析纯)
----二水合磷酸二氢钠(分析纯)
----氢氧化钠(分析纯)
----浓盐酸
----去离子水
六、提供的材料与试剂
1、96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）
2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，2ppb，4ppb，8ppb，16ppb，32ppb
3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm
4、酶标二抗 12ml …………………… 红色帽
5、抗体工作液 10ml …………………… 绿色帽
6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液 7ml …………………… 红色帽
8、终 止 液 7ml …………………… 黄色帽
9、20×浓缩洗涤液 40ml……………………… 透明帽
10、20×浓缩提取液 50ml……………………… 蓝色帽
七、溶液的配制
配液1: 0.02M磷酸盐缓冲液
称取5.36g十二水合磷酸氢二钠、0.2g二水合磷酸二氢钾、8g氯化钠和0.2g氯化钾加去离子水溶解定容至1L
配液2: 0.5 M盐酸溶液
量取41.7ml浓盐酸加去离子水定容至500ml
配液3: 0.2 M 氢氧化钠
称取4g氢氧化钠加去离子水定容至500ml
配液4: 提取工作液
用去离子水将20×浓缩提取液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓 缩提取液+19份去离子水）用于样本的提取，提取工作液在4℃环境可保存一个月。
配液5: 洗涤工作液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
八、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果
（c）所有样本复溶后均不能保存
(一) 高检测限样本
（a）动物组织（鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鸡蛋）
┅┅用均质器均质组织样本；
┅┅称取2.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙腈，立即用振荡器振荡20min，3000g以上离心5min；
┅┅取上清液2ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷用涡旋仪涡动20s溶解干燥残留物，加入1ml 0.02 M磷酸盐缓冲液（见配液1），用涡旋仪涡动1min，3000g以上离心10min；
┅┅除去上层正己烷相，取下层水相20ml用于分析。
（b）动物组织（鱼、虾）
┅┅用均质器均质组织样本；
┅┅称取2.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml去离子水，用涡旋仪涡动至糊状，加入8ml乙腈，立即用振荡器振荡20min，3000g以上离心5min；
┅┅取上清液2.5ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加1ml正己烷用涡旋仪涡动20s溶解干燥残留物，加入1ml 0.02 M磷酸盐缓冲液（见配液1），用涡旋仪涡动1min，3000g以上离心10min；
┅┅除去上层正己烷相，取下层水相20ml用于分析。
（二）低检测限样本提取方法
动物组织（鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝）
┅┅用均质器均质组织样本；
┅┅称取2.0g±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入 10ml提取工作液，充分上下混合振荡10min，再放入37℃恒温箱，30min后取出，3000g以上，10℃离心10min；
┅┅取清亮上清20ml用于分析。
（三）血清前处理方法
┅┅将血样本于室温放置30min，3000g以上，10℃离心10min，分离出血清或过滤血清；
┅┅取1ml血清至10ml干净的玻璃试管中，加入3ml 0.02 M 磷酸盐缓冲液（见配液1）混合均匀；
┅┅取20ml用于分析。
（四）蜂蜜前处理方法
┅┅称取1±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中；
┅┅加入2ml 0.5 M盐酸溶液（见配液2），用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；
┅┅放入37℃培养箱中孵育30min；
┅┅加入5ml 0.2M氢氧化钠（见配液3）（调pH值范围为4～6）用振荡器振荡1min，再加入8ml乙酸乙酯，用振荡器振荡5min，3000g以上离心10min；
┅┅取上层液体至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加1ml 0.02 M磷酸盐缓冲液（见配液1）溶解；
┅┅取20ml用于分析
（五）尿液前处理方法
┅┅将尿液于3000g以上，室温（20-25℃）离心5min，直至尿液样本清亮；
┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干净的玻璃试管中，加入3ml提取工作液混合；
┅┅取20ml用于分析。
（六）牛奶前处理方法
┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；
┅┅移取1ml离心后的牛奶样本至10ml干净的玻璃试管中，加入0.02 M 磷酸盐缓冲液（见配液1）按1︰19的体积比进行稀释（即20ml牛奶+380ml 0.02磷酸盐缓冲液）；
┅┅取20ml用于分析。
九、检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中，然后加抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液5）250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、加酶标二抗：加酶标二抗100ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应20min，取出重复步骤6。
8、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min（见注意事项8）。
