一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法,掌握显微镜下直接计数的技能.
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多,通常采用的有显微直接计数法和平板计数法.
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨.菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板.两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察.而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清.
血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区,计数区的刻度有两种:一种是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成16个小方格.但是不管计数区是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成.
计数区边长为1mm,则计数区的面积为l mm2,每个小方格的面积为1/400mm2.盖上盖玻片后,计数区的高度为0.1mm,所以每个计数区的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为1/4000mm3.
使用血球计数板计数时,先要测定每个小方格中微生物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量.
已知:1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以:1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格,即系数K=4×106 .
因此:每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数(N)×系数(K)×菌液稀释倍数(d)
三、实验器材
1. 活材料:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培养液.
2. 器材:显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm×22mm)、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸.
四、实验方法
1. 视待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释(斜面一般稀释到10-2),以每小格的菌数可数为度.
2. 取洁净的血球计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片.
3. 将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴(不宜过多),让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液.也可以将菌悬液直接滴加在计数区上,不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高.然后加盖盖玻片(勿使产生气泡).
4. 静置片刻,将血球计数板置载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数.由于生活细胞的折光率和水的折光率相近,观察时应减弱光照的强度.
5. 计数时若计数区是由16个大方格组成,按对角线方位,数左上、左下、右上、右下的4个大方格(即100小格)的菌数.如果是25个大方格组成的计数区,除数上述四个大方格外,还需数中央l个大方格的菌数(即80个小格).如菌体位于大方格的双线上,计数时则数上线不数下线,数左线不数右线,以减少误差.
6. 对于出芽的酵母菌,芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算.每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大,否则应重新操作),求出每一个小格中细胞平均数(N),按公式计算出每ml(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量.
7. 测数完毕,取下盖玻片,用水将血球计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度.洗净后自行晾干或用吹风机吹干,放入盒内保存.
五、实验记录
将实验结果填入下表中:
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计数次数
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每个大方格菌数
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稀释位数
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试管斜面中的总菌数
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平均值
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第一次
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第二次
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